實時熒光定量PCR的十大不利操作說明

實時熒光定量PCR的十大不利操作說明

1、引物和探針設計不當

為了*高效地設計用于實時熒光定量PCR的引物和探針，我們強烈建議您使用引物設計軟件。大多數引物設計程序均包含了可調節的參數以設計*佳的引物和探針。這些參數涉及了引物/探針的Tm值、互補性、二級結構以及擴增子大小等重要因素。另外還建議您限制連續的重復核酸數目。當設計用于真核目標序列的擴增子時，請選擇在目標mRNA中至少跨越一個外顯子-外顯子接合點的PCR引物對，以避免從殘留的基因組DNA模板擴增目標片段。

2、使用了低質量的RNA

已降解的或低純度的RNA會抑制反轉錄效率并降低得率。所用的RNA應當來自于新鮮組織，或者經過RNA穩定試劑處理過的組織，如RNAlater短片段試劑（70–250 bp）等。這樣可以避免少部分降解RNA對結果的影響。若無法使用完全完整的RNA，則可以使設計的引物對與感興趣基因內部區域進行匹配。需要注意的是，對于真正的實時熒光定量PCR，部分降解的RNA可能無法給出基因表達的精que結果。

3、未使用“預混液”

qRT-PCR是一種分析RNA的高靈敏工具。由于PCR反應會擴增目的基因，所以誤差也會被同時擴增出來。因此，無論何時都應當確保變異處于*低水平?！邦A混液”是反應試劑的混合液，在設置建立多個反應時應當使用它來*小化樣品間和反應孔間的差異以提高可重復性。為了進一步減少孔間差異，可以向預混液中加入ROX等參比熒光。

4、引入交叉污染

對PCR區域的所有表面均應當使用DNA去污染試劑來進行日常去污染工作以防止交叉污染，推薦使用如DNAzap的試劑，其可以破壞DNA?？梢允褂谩盁o模板對照“（NTC）來排除試劑和實驗桌面的交叉污染。NTC含有除RNA模板外的所有RT-PCR試劑。通常是用無核酸酶水簡單地替換掉反應中的RNA。反應后NTC中應當沒有合成任何產物；若有產物被合成了，則意味著RT-PCR試劑中的一種或多種被擴增產物污染了。

5、未使用“– RT”對照

在RNA制備過程中，事實上不可能完全去除基因組DNA。因此，在qRT-PCR實驗中有必要加入無逆轉錄酶對照（“非擴增對照“，還可記為NAC）。通常，NAC是一個模擬的逆轉錄反應，其中含有除逆轉錄酶之外的所有RT-PCR試劑。若在NAC中可觀察到產物，通常意味著樣品中殘留有DNA。

6、使用了不適當的均一化對照

任意qRT-PCR實驗的可靠性均可以通過在實驗中引入一個不變的內參對照得到改善，這樣做有助于改善qRT-PCR的樣品間差異以及樣品定量過程中的誤差。一個好的對照，其表達水平應當在所分析的樣品中保持不變。通常我們使用18S rRNA作為對照，因為它相比其他傳統內參對照如?-actin或GAPDH等表達水平變化更小。

7、使用SYBR Green時未進行熔解曲線分析

理想情況下，實驗樣品在擴增子熔解溫度下會產生一個清晰的峰（一階導數圖），而NAC及NTC則不會產生任何明顯的熒光信號。這類結果意味著PCR產物是特異性的，且此時SYBR Green I 熒光是對目的產物的累積的直接測量。若熔解曲線顯示為一系列的峰，則意味著此時很難分辨出特異性及非特異性反應產物。為了獲取有意義的數據，這種情況下必須對qRT-PCR進行優化。

8、沒有正確地設置基線和閾值線

為了得到精que的Ct值，應當在豐度*高的樣品所對應Ct值兩個循環之前設置基線。為了使實時熒光定量PCR的數據有意義，應當在指數擴增期設置閾值線。典型情況下，閾值應當設置在基線至少10個標準差范圍內。

9、擴增效率低

擴增效率(Eff)可以通過以下公式進行計算：

Eff = 10 (–1/slope) – 1

PCR的效率應當在90-110%之間（3.6 > 斜率 > 3.1）。有一系列變量會影響到PCR的效率。舉例來說，這些因素包括擴增子的長度、二級結構以及引物設計等。盡管擴增效率落在上述范圍之外時，我們也可以得到有效數據，但是仍然應當對qRT-PCR進行進一步優化或改變擴增子設計。

10、使用不正確的范圍來制作標準曲線

在RNA定量研究（優良或相對定量）中或驗證PCR（delta-delta-Ct）的擴增效率時，對于每個基因都應當制備標準曲線。標準曲線數據點應當覆蓋您的目標基因期望豐度。額外的數據點也可以包括在內，例如在極限上下方的*小及*大RNA量等，以幫助區分特異性和非特異性產物。